Patolojide moleküler test denildiğinde çoğunlukla:
- mutasyon,
- delesyon/amplifikasyon,
- füzyon,
- TMB,
- MSI
düşünüyoruz.
Ancak özellikle santral sinir sistemi tümörlerinde son yılların en önemli gelişmelerinden biri DNA methylation profiling oldu.
Buradaki amaç tek bir genin promoter metilasyonuna bakmak değil.
Tümörün yüz binlerce CpG bölgesindeki epigenetik paternini ölçerek onun “moleküler kimliğini” belirlemek.
Bu nedenle metilasyon profili, patolog açısından genomik bir mutasyon testinden çok “moleküler morfoloji” gibi düşünülebilir.
Metilasyon profili tam olarak neyi ölçüyor?
DNA metilasyonu çoğunlukla CpG bölgelerindeki sitozine metil grubu eklenmesidir.
DNA dizisi değişmez:
C yine C'dir.
Ancak hücrenin:
- diferansiyasyonu,
- kökeni,
- transkripsiyonel programı,
- tümör biyolojisi
değişir.
İlginç olan, aynı histolojiye benzeyen farklı tümörlerin oldukça farklı methylation fingerprints gösterebilmesidir.
Buna karşılık aynı biyolojik tümör grubunun farklı morfolojileri benzer bir methylation class altında birleşebilir.
Bu özellik CNS tümörlerinde özellikle güçlüdür. (1,2)
Peki standart NGS ile metilasyona bakabilir miyiz?
Standart DNA paneli ile: Hayır
Klasik hedefli NGS:
A / C / G / T dizisini
okur.
Ancak standart short-read DNA sequencing sırasında metillenmiş sitozin ile metillenmemiş sitozin arasındaki fark korunmaz.
Dolayısıyla:
Mevcut bir 500–700 genlik standart DNA panelini çok derin sekanslamak metilasyon profilini ortaya çıkarmaz.
Aynı şekilde mevcut standart FASTQ veya BAM dosyasını yeni bir yazılıma yükleyerek geriye dönük metilasyon profili elde etmek mümkün değildir.
Sorun bioinformatik değil, library preparation ve sequencing chemistry sorunudur.
NGS ile metilasyon nasıl ölçülüyor?
Birkaç farklı teknoloji bulunuyor.
| Yöntem | NGS mi? | Temel özellik |
|---|---|---|
| Illumina EPIC methylation array | Hayır | Günümüzde klinik CNS sınıflamasında en yerleşmiş yöntem |
| Bisulfite sequencing | Evet | Metillenmiş ve metillenmemiş C'leri kimyasal olarak ayırır |
| Whole-genome bisulfite sequencing | Evet | Neredeyse tüm methylome'u değerlendirir |
| Enzymatic methyl-seq (EM-seq) | Evet | Bisulfite göre DNA'yı daha az hasarlayan yaklaşım |
| Targeted methylation sequencing | Evet | Seçilmiş CpG bölgelerini hedefler |
| Nanopore sequencing | Evet | Native DNA'daki metilasyonu doğrudan okuyabilir |
Burada özellikle iki teknoloji gelecekte patoloji laboratuvarlarını etkileyebilir:
EM-seq ve nanopore sequencing.
Bugünkü klinik standart hâlâ methylation array
CNS tümörlerinde en geniş referans veri setleri halen:
Illumina methylation array
verileri üzerine kuruludur.
EPIC platformları yüz binlerce CpG bölgesini aynı anda değerlendirir.
Ortaya çıkan profil daha sonra:
Heidelberg / Molecular Neuropathology (MNP) classifier
veya başka doğrulanmış sınıflandırıcılara gönderilir.
Sonuç basitçe:
“Metilasyon var / yok”
şeklinde değildir.
Örneğin:
Methylation class: AT/RT, MYC
veya
Methylation class: Ependymoma, posterior fossa group A
gibi bir biyolojik sınıf elde edilir.
2026: Heidelberg classifier artık çok daha geniş
2018'de Capper ve arkadaşlarının çalışması methylation classifier yaklaşımını nöropatoloji pratiğine taşıyan temel kilometre taşıydı. (1)
2026'da yayımlanan yeni Heidelberg sınıflandırıcısı v12.8, yaklaşık 7.500 referans methylation profili kullanılarak geliştirilmiş ve sınıflandırma sistemi yaklaşık 184 alt sınıfa genişletilmiştir. (4)
Yeni yapı yalnız:
“hangi tümör?”
sorusuna değil;
superfamily → family → class → subclass
şeklinde hiyerarşik sonuç vermeye yöneliyor.
Bu özellikle ultra-nadir CNS tümörlerinde oldukça önemli.
Çünkü yeni tümör antitelerinin önemli bir kısmı aslında:
morfolojik olarak birbirine benzeyen olguların methylation kümelerinin ayrılması
ile keşfedildi.
Patolog açısından methylation classifier ne zaman gerçekten değerli?
2025 cIMPACT-NOW Update 9 bu konuda oldukça pratik bir yaklaşım öneriyor. (2)
Metilasyon profili özellikle:
1. Morfolojik ayırıcı tanı çözülemiyorsa
Örneğin:
embryonal tumor NOS
veya
high-grade neuroepithelial tumor
şeklinde kalacak bir olguda.
2. Morfoloji ile moleküler bulgular çelişiyorsa
Örneğin histoloji bir tümörü düşündürüyor ancak beklenen:
- füzyon,
- mutasyon,
- IHK paterni
uyuşmuyorsa.
3. WHO tanısı için moleküler alt sınıflama gerekiyorsa
Özellikle bazı:
- pediatrik gliomlar,
- ependymomlar,
- embryonal tümörler,
- glioneuronal tümörler
için.
4. Çok nadir veya yeni tanımlanan bir tümörden şüpheleniliyorsa
Burada methylation profiling bazen tanıyı çözen en güçlü yöntem olabilir.
Ancak classifier patologun yerine geçmiyor
Bu nokta cIMPACT-NOW'un da özellikle vurguladığı konu:
Methylation classifier sonucu tek başına tanı değildir.
Mutlaka:
klinik + lokalizasyon + radyoloji + histoloji + IHK + genomik bulgular
ile birlikte değerlendirilmelidir.
Örneğin classifier yüksek skorla beklenmedik bir tümör sınıfı veriyorsa:
“Bilgisayar söyledi, tanı budur”
demek yerine preparata geri dönmek gerekir.
Bazen classifier sonucu aslında:
“Bu vakaya tekrar bakmalısın.”
uyarısıdır.
Bu yönüyle metilasyon profili patoloğun yerini almak yerine ikinci bir moleküler göz gibi çalışır.
Bir methylation assay'den CNV de çıkabilir
Metilasyon arraylerinin patolog açısından önemli avantajlarından biri, aynı veri üzerinden:
genomik copy-number profile
oluşturulabilmesidir.
Örneğin:
- EGFR amplifikasyonu,
- CDKN2A/B delesyonu,
- kromozom 7 kazanımı / 10 kaybı,
- 1p/19q paterni,
- MYCN amplifikasyonu,
- C19MC amplifikasyonu
gibi değişiklikler görülebilir.
Dolayısıyla tek testten:
methylation class + CNV landscape
elde etmek mümkündür.
Ancak CNV bulguları yine morfolojik ve diğer moleküler sonuçlarla entegre edilmelidir. (2)
MGMT promoter methylation ile karıştırmayalım
Burada terminolojik olarak önemli bir ayrım var.
MGMT promoter methylation
Tek bir gen bölgesinin prediktif biyobelirteç olarak değerlendirilmesidir.
Genome-wide methylation profiling
Yüz binlerce CpG'nin birlikte değerlendirilerek tümörün sınıflandırılmasıdır.
Yani:
MGMT metilasyonu ≠ methylation classifier
MGMT:
“Bu promoter metile mi?”
sorusuna cevap verir.
Classifier ise:
“Bu tümör biyolojik olarak hangi tümör ailesine ait?”
sorusuna cevap verir.
Aynı methylation array veya bazı yeni sequencing platformlarından her iki bilgi de üretilebilir, ancak bunlar farklı biyolojik çıktılardır.
Büyük gelişme: Artık array zorunlu olmayabilir
Yakın zamana kadar Heidelberg classifier'ın en önemli sınırlamalarından biri:
array verisi gerektirmesiydi.
2025'te geliştirilen MNP-Flex bu konuda önemli bir değişiklik yarattı. (3)
Bu platform-agnostic classifier;
- methylation array,
- whole-genome bisulfite sequencing,
- nanopore sequencing,
- bazı methylation sequencing panelleri
gibi farklı kaynaklardan gelen verileri aynı sınıflandırma sistemine dönüştürebiliyor.
Doğrulama çalışması:
on binlerce FFPE ve frozen örneği
ve farklı teknolojileri içerdi.
Bu gelişme önemli çünkü gelecek muhtemelen:
“Herkes aynı cihazı kullanmalı”
yerine
“Farklı cihazlardan gelen methylation verisi aynı referans atlasında sınıflandırılabilir”
yönünde ilerliyor.
Nanopore neden özellikle ilginç?
Klasik short-read NGS'den farklı olarak nanopore, DNA molekülünü native haliyle okur.
Bu nedenle aynı DNA molekülünden:
- DNA dizisi,
- SNV / indel,
- structural variation,
- copy number,
- DNA methylation
bilgisi elde edilebilir.
Üstelik bisulfite dönüşümüne gerek yoktur.
2025'te yayımlanan prospektif çok merkezli Rapid-CNS² çalışması bu yaklaşımın ne kadar ilerlediğini gösterdi. (3)
Sistem:
yaklaşık 30 dakika içerisinde methylation classification + geniş CNV bilgisi
üretebildi.
Sekanslamaya devam edildiğinde ise yaklaşık bir gün içerisinde:
- mutasyonlar,
- indeller,
- füzyon / structural variant,
- CNV,
- MGMT promoter methylation,
- ayrıntılı methylation class
aynı platformdan çıkarılabildi.
Bu, moleküler nöropatoloji açısından oldukça önemli bir paradigma değişikliğidir.
İntraoperatif moleküler tanı bile mümkün hale geliyor
Nanopore tabanlı MethyLYZR, Sturgeon, Rapid-CNS gibi yaklaşımlar sparse methylation verisini kullanarak tümör sınıflandırması yapabiliyor.
Yani genomun tamamının okunmasını beklemek gerekmiyor.
Yeterli sayıda ayırt edici CpG bölgesi okunduğu anda algoritma sınıflandırmaya başlayabiliyor.
Bu nedenle gelecekte frozen sırasında:
“high-grade glioma”
demekle yetinmek yerine,
aynı operasyon devam ederken moleküler tümör ailesinin tahmin edilmesi teorik olmaktan çıkmış durumda. (3,6)
FFPE kullanılabilir mi?
Evet.
Bu klinik patoloji açısından çok önemli.
Methylation array uzun süredir FFPE materyalde kullanılabiliyor.
Daha yeni çalışmalar nanopore sequencing ile FFPE materyalden de methylation classification ve CNV profilinin mümkün olabileceğini gösteriyor. (5)
Ancak:
- DNA fragmentasyonu,
- tümör hücre oranı,
- nekroz,
- normal beyin kontaminasyonu,
- DNA miktarı
classifier performansını etkileyebilir.
Dolayısıyla preparatın patolog tarafından seçilmesi yine kritik.
Tümör hücre oranı neden önemli?
Methylation profiling tümör hücrelerini fiziksel olarak ayırmaz.
Örneğin örnek:
%20 tümör + %80 normal beyin
içeriyorsa elde edilen epigenetik profil seyrelir.
Bu durum:
- classifier skorunu düşürebilir,
- yanlış komşu sınıfa yönlendirebilir,
- CNV amplitüdünü azaltabilir.
Bu nedenle moleküler örnek seçimi klasik patoloji pratiğinden bağımsız değildir.
H&E üzerinden tümör alanının seçilmesi ve mümkün olduğunca tümörce zengin bölgenin makrodiseksiyonu methylation profiling için de önemlidir.
AT/RT örneğinde neden yararlı?
Önceki AT/RT örneğine dönersek:
INI1 kaybı + uygun embryonal/rhabdoid morfoloji
çoğu klasik olguda tanı için oldukça güçlüdür.
Ancak:
- olağandışı yaş,
- alışılmadık lokalizasyon,
- INI1-kayıp başka CNS tümörü olasılığı,
- morfolojik uyumsuzluk
varsa methylation profiling önemli olabilir.
Ayrıca AT/RT'nin:
- AT/RT-TYR
- AT/RT-SHH
- AT/RT-MYC
epigenetik alt gruplarının ayrılmasında metilasyon profili çok güçlüdür.
Burada sequencing paneli SMARCB1 değişikliğini gösterebilir;
methylation classifier ise:
“Bu genomik değişikliği taşıyan tümör biyolojik olarak gerçekten hangi tümör sınıfına ait?”
sorusuna yardım eder.
Mevcut kapsamlı NGS paneline eklenebilir mi?
Pratik açıdan en önemli soru bu.
Mevcut standart panel verisine yazılımla eklemek
Hayır.
Standart DNA capture panelinden çıkan BAM dosyasında methylation bilgisi artık yoktur.
Aynı short-read sequencing cihazında ayrı assay olarak yapmak
Evet, teknik olarak mümkün.
Ayrı bir:
- bisulfite-seq,
- enzymatic methyl-seq,
- targeted methylation-seq
library hazırlanabilir.
Yani sekanslama cihazının mutlaka değiştirilmesi gerekmez.
Ancak:
library preparation + hedef CpG tasarımı + bioinformatik pipeline tamamen ayrı olacaktır.
Mevcut yüzlerce genlik somatik panel yalnız CpG bölgeleri eklenerek otomatik olarak CNS methylation classifier'a dönüşmez.
Classifier'ın tanıdığı referans CpG uzayının yeterli şekilde örneklenmesi gerekir.
En entegre çözüm
Gelecekte en ilginç yaklaşım:
Nanopore
Çünkü teorik olarak aynı örnekten:
SNV + indel + CNV + SV/füzyon + methylation
tek native DNA workflow'u içerisinde üretilebilir.
Rapid-CNS² bunun artık yalnız araştırma fikri olmadığını gösteriyor.
Ancak klasik kısa-okuma hedefli NGS'nin yerine hemen geçecek kadar standartlaşmış değildir.
Ben bir patoloji laboratuvarında bugün nasıl kurardım?
Aşama 1 — Klinik olarak güvenli başlangıç
Illumina EPIC methylation array + doğrulanmış CNS classifier
Özellikle:
- pediatrik CNS tümörleri,
- embryonal tümörler,
- zor glioneuronal tümörler,
- ependymomlar,
- morfoloji/moleküler uyumsuz olgular
için seçici kullanım.
Aşama 2 — Mevcut NGS ile entegrasyon
Somatik DNA/RNA NGS:
mutasyon + füzyon + TMB/MSI/CNV
için devam eder.
Methylation profiling ayrı fakat tamamlayıcı bir assay olur.
Aşama 3 — Gelecek platformu
Nanopore + MNP-Flex benzeri classifier
ile aynı örnekten genomik + epigenomik profil.
Bence önümüzdeki birkaç yılın en önemli moleküler patoloji gelişmelerinden biri tam olarak bu entegrasyon olacak.
Patoloji raporunda nasıl yazılmalı?
En uygun yaklaşım “layered diagnosis” şeklindedir.
Örneğin:
Histolojik tanı:
Embryonal/rhabdoid malign neoplazi
İmmünfenotip:
SMARCB1/INI1 nükleer ekspresyon kaybı
DNA methylation profiling:
Methylation class: AT/RT, MYC
Classifier calibrated score: xxx
Entegre tanı:
Atypical teratoid/rhabdoid tumor, CNS WHO grade 4
Bu yapı classifier'ı patoloğun yerine koymaz.
Tam tersine:
Morfoloji + IHK + genomik + epigenomik verinin birlikte yorumlandığını gösterir.
Patolog İçin Akılda Kalacak 7 Nokta
1. Methylation profiling, MGMT promoter methylation ile aynı şey değildir.
2. Standart DNA NGS panelinden geriye dönük methylation profili çıkarılamaz.
3. Metilasyon NGS ile çalışılabilir; bunun için bisulfite, EM-seq veya benzeri özel yöntem gerekir.
4. Nanopore native DNA'dan metilasyonu doğrudan okuyabilir.
5. CNS tümörlerinde methylation classifier artık yalnız araştırma aracı değil, gerçek bir diagnostik yardımcıdır.
6. Classifier sonucu tek başına tanı değildir; morfoloji, IHK, radyoloji ve genomik ile entegre edilmelidir.
7. Gelecek muhtemelen ayrı “NGS” ve “methylation” testlerinden ziyade aynı örnekten genomik + epigenomik profil üreten multi-omic sistemlerdir.
Sonuç
DNA methylation profiling patolog açısından yalnız yeni bir moleküler test değildir.
Aslında çok daha farklı bir bilgi katmanı sağlar:
NGS çoğunlukla tümörün hangi genetik değişiklikleri taşıdığını söyler.
Methylation profiling ise tümörün biyolojik olarak “kim olduğunu” söylemeye çalışır.
Bu nedenle özellikle nöropatolojide iki teknoloji rakip değil tamamlayıcıdır:
Histoloji → hücre nasıl görünüyor?
NGS → genomda ne değişmiş?
Methylation → bu epigenetik kimlik hangi tümör sınıfına ait?
2025–2026 gelişmeleri ise bu üç veri katmanının giderek aynı moleküler workflow içerisinde birleşmeye başladığını gösteriyor.
Kaynaklar
(1) Capper D, et al.
DNA methylation-based classification of central nervous system tumours.
Nature. 2018;555:469-474.
PMID: 29539639. DOI: 10.1038/nature26000.
(2) Aldape K, Capper D, von Deimling A, et al.
cIMPACT-NOW update 9: Recommendations on utilization of genome-wide DNA methylation profiling for central nervous system tumor diagnostics.
Neuro-Oncology Advances. 2025;7:vdae228.
PMID: 39902391. DOI: 10.1093/noajnl/vdae228.
(3) Patel A, Göbel K, Ille S, et al.
Prospective, multicenter validation of a platform for rapid molecular profiling of central nervous system tumors.
Nature Medicine. 2025;31:1567-1577.
PMID: 40133526. DOI: 10.1038/s41591-025-03562-5.
(4) Sill M, Schrimpf D, Patel A, et al.
Advancing CNS tumor diagnostics with expanded DNA methylation-based classification.
Cancer Cell. 2026;44:340-354.e2.
PMID: 41349541. DOI: 10.1016/j.ccell.2025.11.002.
(5) Afflerbach AK, et al.
Nanopore sequencing from formalin-fixed paraffin-embedded specimens for copy-number profiling and methylation-based CNS tumor classification.
Acta Neuropathologica. 2024;147:74.
DOI: 10.1007/s00401-024-02731-z.
(6) Rapid brain tumor classification from sparse epigenomic data.
Nature Medicine. 2025.
DOI: 10.1038/s41591-024-03435-3.
(7) Al Sharie S, Sawaftah K, Qasim H, Al-Hussaini M.
Methylation profiling in neuropathological tumors diagnosis: a comprehensive review.
Frontiers in Oncology. 2025;15:1720458.
PMID: 41487568. DOI: 10.3389/fonc.2025.1720458.
Etiket: Moleküler Patoloji / Nöropatoloji / DNA Metilasyonu / NGS / Epigenetik